细胞凋亡检测是生物医疗研究中一项关键技术，广泛应用于疾病机制的探索、药物筛选等领域。接下来，本文将详细介绍如何使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。

实验原理

在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）会转移至膜外侧，暴露在细胞外环境中，同时细胞膜的通透性会增加，因此PS特异性结合的Annexin V探针可以对这些细胞进行标记。Annexin V是一种依赖于Ca²⁺的磷脂结合蛋白，对PS具有极强的亲和力。同时，PI作为一种经济且稳定的核酸染料，不能穿透正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但可进入晚期凋亡和坏死细胞的细胞膜，从而使细胞核染成红色。当Annexin V与PI联合使用时，活细胞和早期凋亡细胞不被染色，而晚期凋亡和坏死细胞则显示为双阳性。

实验材料准备

• Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒
• 细胞样本（悬浮细胞或贴壁细胞）
• 离心机
• PBS
• 荧光显微镜或流式细胞仪

实验方法

1. 细胞收集

悬浮细胞：在1000g下离心5分钟，弃去上清。加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，1000g离心5分钟，再弃去上清，保留细胞沉淀。

贴壁细胞：小心吸取细胞培养液保存备用。用PBS洗涤后，加入适量不含EDTA的胰酶消化液消化细胞。加入之前收集的培养液，轻轻吹打细胞以形成单细胞悬液，接着以1000g离心5分钟，弃去上清。再加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，1000g离心5分钟后，保留细胞沉淀。

2. 重悬细胞

将细胞重悬于195μL Binding Buffer中，轻轻混匀以达到适宜浓度。

3. 加入染料

①加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，用于检测早期凋亡细胞（磷脂酰丝氨酸外翻）。
②加入10μL PI Stain，轻轻混匀，用于检测晚期凋亡细胞或坏死细胞（DNA染色）。

4. 孵育

在室温下避光孵育10-20分钟，以确保染料与细胞充分结合。

检测与分析

流式细胞仪检测

1. 设置适当的通道以检测Annexin V-FITC和PI的荧光信号。
2. 设置三组对照非常重要，以帮助校正背景信号并确定凋亡细胞的比例：未染色组、PI单染组和Annexin V-FITC单染组，分别用于检测自然荧光和确定阳性阈值。

荧光显微镜检测

1. 离心后用少量Binding Buffer重悬细胞，制备涂片。
2. 在荧光显微镜下观察，通常Annexin V-FITC发出绿色荧光，PI则发出红色荧光。
3. 可通过拍照或计数来定量分析凋亡细胞的比例。

注意事项

• 在整个操作过程中尽量保持低温，以减少细胞代谢和自发荧光。
• 避免长时间暴露在光线下，特别是FITC类染料，以防光照导致荧光淬灭。
• 根据实验需求调整细胞数量和染料浓度。
• 如使用流式细胞仪，确保仪器已校准，并正确设置通道。

此检测方案与尊龙凯时品牌高度相关，作为生物医疗领域的先行者，尊龙凯时致力于提供高质量的实验材料与技术支持，助力科研工作者在细胞凋亡研究以及其他生物医学探索中取得更大突破。